Сайт преподавателя химии и биологии Коноваловой Лидии

Методы гистологического и эмбриологического исследования

Гистология — наука, изучающая строение и физиологию тканей организмой. Для исследований применяются различные методы.

Метод

Описание метода

Микроскопический

Гистологические и эмбриологические исследования неразрывно связаны и данным методом. Наиболее часто в этих исследованиях используется световой микроскоп. Кроме обычного светового микроскопа, в гистологии и эмбриологии используются микроскопы специального назначения:

·  фазово-контрастные;

·  интерференционные;

·  микроскопы с конденсором темного поля;

·  люминесцентные или флуоресцентные;

·  поляризационные.
Фазово-контрастные и интерференционные микроскопы с конденсором темного поля служат для исследования неокрашенных клеток и тканей. Люминесцентные микроскопы используются для исследования естественной и искусственной люминесценции клеток и тканей. Поляризационные микроскопы предназначены для исследования ультраструктуры клеток, имеющих закономерные, регулярные структуры. Электронные и растровые используются для исследования ультраструктуры клеток. Стереосканные микроскопы дают объемное изображение объекта исследования.

Тотальный

Достаточно растпространенный метод в гистологии, когда рассматриваются целые, нерасчлененные объекты, а сами препараты называются тотальными. К тотальным препаратам могут быть отнесены кровь, лимфа, половые клетки, зародыши ранних стадий развития, тонкие пленки тканей растений и животных.

Метод окрашивания

Для исследования большинства объектов в лучах проходящего света необходимо, чтобы они были тонкими, прозрачными и контрастными. Для того чтобы сделать объект тонким, его необходимо разрезать на тончайшие пластинки, которые называются гистологическими срезами. Чтобы объект сохранил по возможности прижизненное строение, его фиксируют, а для того, чтобы сделать его контрастным, используют данный метод.

Метод фиксированных и окрашенных постоянных препаратов

Данный метод является основным, или классическим. Для их изготовления объект исследования прогружают в фиксирующие жидкости, которые денатурируют белки и стабилизируют определенные структуры и соединения, подлежащие исследованию. Наиболее распространенным фиксатором является формалин. Он сшивает белки метиленовыми мостиками, вызывая их денатурацию. После фиксирования и промывания в воде объект исследования можно резать на тонкие пластинки, предварительно заморозив его на специальном замораживающем микротоме — приборе, при помощи которого изготовляют гистологические срезы. Для замораживания объекта чаще всего используют жидкий углекислый газ либо электрозамораживающую установку. Однако при таком методе обработки материала получают довольно толстые гистологические срезы. Для изготовления более тонких срезов, толщиной до 2 мкм, объект исследования необходимо пропитать веществом, которое сделало бы его более плотным. Такими веществами являются парафин, желатин и целлоидин. Объект после фиксирования и промывания погружают последовательно в спирты возрастающей концентрации — от 50 до 100 градусов для его обезвоживания и пропитывают желатиной, парафином или целлоидином. После пропитывания и уплотнения объекта его можно резать на микротоме.
Гистологические срезы затем окрашивают специально подобранными красителями, большинство из которых избирательно окрашивает структурные компоненты клеток и тканей. Все красители можно разделить на три группы:

·  щелочные, или ядерные. Ими окрашивают ядра клеток и некоторые другие структуры, имеющие кислую реакцию, например эндоплазматическую сеть. Примером щелочных красителей могут быть гематоксилин, кармин, сафранин;

·  кислые, или цитоплазматические, которыми окрашивают цитоплазму клеток. Наиболее распространенными кислыми красителями являются эозин, пикриновая кислота, кислый фуксин, индигокармин;

·  специального назначения — избирательно окрашивают структурные компоненты клеток либо вещества определенной химической природы. Наиболее распространенными красителями специального назначения являются судан III, осмиеловая кислота, окрашивающая жиры и жироподобные вещества; орсеин, окрашивающий эластин.
После окрашивания гистологические срезы быстро обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле или толуоле, переносят на предметное стекло, заливают тонким слоем канадского бальзами или полистирола и накрывают покровным стеклом. Бальзам, полистирол и стекло имеют одинаковый показатель преломления света, и лучи света минимально рассеиваются, проходя через препарат.

Метод прижизненного или витального окрашивания клеток и тканей

Экспериментальным животным в кровяное русло или в брюшную полость вводят красители, а затем исследуют их локализацию в клетках и тканях. Следовательно, при помощи этого метода исследуют структуры в живых клетках и изучают процессы их жизнедеятельности. Наиболее распространенными витальными красителями являются трипановый синий, нейтральный красный, нильский синий, которые употребляют в больших разведениях — 1 : 1000 и более.

Метод изготовления временных препаратов

Преимуществом временных препаратов перед постоянными является быстрота их изготовления и возможность наблюдать живые клетки и ткани. Временные препараты делают из мазков, соскобов, тонких пленок, расщепленных объектов или путем растягивания стенок полых органов. Объекты рассматривают в капле воды или физиологического раствора, либо в натуральном виде, либо подкрашивая их слабыми растворами витальных красителей.

Метод культуры тканей

Имеет большое значение при изучении процессов эмбрионального гистогенеза, регенерации и трансплантации тканей. Широко применяется в гистологии и эмбриологии. Суть данного метода в том, что отдельные клетки определенных тканей выделяют в стерильных условиях и культивируют в питательной среде, которая состоит из многих компонентов, необходимых для жизнедеятельности клеток. Клетки теплокровных животных культивируют в термостате при температуре тела, а холоднокровных — при комнатной температуре. Время от времени клетки пересевают на свежую питательную среду и используют на протяжении многих лет для экспериментов.

Метод микрохирургии

Используется для проведения экспериментов на клетках, тканях и зародышах в гистологии и эмбриологии. При помощи таких микроопераций можно, например, выделить из ткани отдельную клетку, удалить из клетки ядро, перенести ядро из одной клетки в другую или переместить часть клеток зародыша, разъединить бластомеры дробящегося яйца. Все эти эксперименты осуществляются при помощи прибора, который называется микроманипулятором. В состав этого прибора входят микроскоп, система рычагов с различной степенью плавного регулирования. К рычагам присоединяются миниатюрные инструменты: стеклянные капилляры, иглы, крючки.

Метод авторадиографии

Обнаруживаются вещества, меченные радиоактивными изотопами. Этот метод получил название гистохимического или цитохимического метода исследования.

Метод электронномикроскопического исследования

Изучение препаратов при помощи электронного микроскопа. В электронном микроскопе вместо пучка света используется пучок электронов, движущийся в вакууме, вместо оптических частей — магнитные поля, вместо глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку. Прямое увеличение электронных микроскопов достигает 600 тыс. раз.